肿瘤免疫治疗新贵——CAR-T(3)

　　scFv由重链、轻链以及之间的linker连接而成，所以将不同的重链和轻链随机组合，可以建成人源化的scFv组合抗体文库，再通过表达量、稳定性、与抗原的亲和力等指标进行筛选。高通量筛选主要通过噬菌体展示技术。该技术最大的优点是直接将表达出来的抗体与其基因型联系在一起，再利用抗原-抗体的特异性结合，将感兴趣的抗体挑选出来。通过噬菌体技术，可高效获得scFv人源化片段，提高CAR-T的安全性和有效性。

　　scFv序列是CAR-T研发中的核心技术，从华创证券的调研信息来看，筛选一个合适的scFv序列，时间成本和费用成本都不低，鼠源性的成本在几十万元，人源化的则需要上百万元。目前很多科研机构使用的序列是从文献上获取的，原则上只能用于科研。所以如果要做创新型CAR-T并进行商业化，则需要科研机构或企业自主研发筛选。

　　为实现CAR在T细胞上的表达，需要通过载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。目前有多种载体用于CAR-T细胞产品制备，包括病毒载体转导（如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体）及非病毒载体转染（如转座子转染、mRNA电穿孔转染）等，虽然已开展的临床试验以病毒载体转导方式为主，但以非病毒载体转染的方式也在获得青睐。

　　慢病毒载体是目前应用最多的载体系统。病毒基因转移载体的主要优点是制造、生产相对容易，并且能够将遗传物质稳定整合到宿主基因组中。但病毒载体的致病性和潜在的插入诱变可能性在人类临床试验中存在显著的监管障碍，所以非病毒载体的开发显得十分重要。转座子和mRNA电穿孔技术是目前研究比较多的两类非病毒载体系统。转座子最终可能发展成多功能T细胞基因转移系统，但目前的DNA电穿孔方法通常产生较差的细胞活力，临床应用中需要扩大T细胞培养，以产生大量 T 细胞。mRNA电穿孔被认为是目前最安全的T细胞基因转导方法，其可转导静止或增殖缓慢的T细胞，转导效率多在90%以上，且设计相对容易，性价比高。临床上已经使用利用瞬时mRNA转染产生的CAR-T细胞，然而，这种方法需要几轮CAR-T细胞输注。在临床前模型中，mRNA电穿孔转导的靶向间皮素的CAR-T能引起播散性间皮瘤异种移植物的消退，然而，在灌输49天后一名患者出现了过敏反应。

　　CAR-T细胞的制备需要一些小心操作的步骤，而且整个过程中都需进行质量监控测试。CAR-T的GMP制备工艺主要包括：T细胞收集和分离、T细胞激活和修饰、T细胞扩增、T细胞收获与回输。生产过程通常需要5～10天，从收集到回输需要2～4周（根据患者的临床状态和化疗预处理方案确定）。